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梅毒的实验诊断技术进展
梅毒的实验诊断技术
梅毒(syphilis)是由苍白螺旋体(Trepomema pallidum)引起的一种慢性经典性病。本病表现极为复杂,几乎可侵犯全身各个器官,病期长,临床症状复杂,发展过程时隐时现,既可产生多种多样的症状和体征,又可以很多年无症状而呈潜伏状态。
梅毒主要通过□传播,也可以通过胎盘传给下一代而发生胎传梅毒。 梅毒螺旋体是一种小而纤细的螺旋体状微生物,长度为5μm-20μm,平均8μm-10μm,直径<0.2μm,有6-12个螺旋,因其透明不易染色,故称为苍白螺旋体。
梅毒螺旋体的基本结构为一原生质的圆柱体,被两层膜所围绕,一束平行的纤维附着于内膜,并以螺旋状方式环绕原生质圆柱体;轴纤维从螺旋体的一端伸到另一端,穿过两层膜并环绕于原生质圆柱体的外面。轴纤维维持螺旋体的弹性,并具有屈曲与收缩功能。梅毒螺旋体的特征是螺旋整齐而规则,折光性强,较其他螺旋体亮;其运动缓慢而有规律,具有三种特征性的运动方式;常见的是围绕其长轴旋转前后移动;其次是全身弯曲如蛇行;少见的是伸缩其螺旋间距而前进。
梅毒螺旋体并不是严格的厌氧菌。研究表明:梅毒螺旋体具有一种微量需氧的性质,所需氧的最适浓度为1%-3%。因为梅毒螺旋体可于皮肤组织内大量增殖,而这些组织正含有这一浓度的氧,所以它在人体内可以长久生存和增殖。但在体外不易存活,煮沸、干燥、肥皂水,一般的消毒剂如汞剂、石炭酸、乙醇等很容易将其杀死。在41℃-42℃时,经过一二小时也可将其杀死。
由于梅毒螺旋体不能在人工培养基上生长,目前只能将其接种于家兔睾丸内来保存和传代。它在低温(-78℃~-196℃)下可保存数年并保持其形态、活力及毒性。它以横断分裂的方式进行增殖,世代时间为30小时-33小时。
梅毒螺旋体感染的组织病理变化为:血管内皮细胞肿胀、增生、血管周围有浆细胞、淋巴细胞呈围管性浸润。在硬下疳及二期损害中浸润细胞主要为淋巴细胞及浆细胞,也有巨噬细胞,但巨细胞罕见。一期及二期中的肿大的淋巴结显示明显有的皮质区滤泡性淋巴样增生,在萎缩的副皮质区伴有组织细胞浸润。晚期活动性梅毒损害有大量的淋巴细胞、浆细胞、巨噬细胞浸润,有时有巨细胞。晚期心血管及中枢神经系统梅毒有相似的细胞浸润。先天梅毒的组织病理与早期或晚期活动性后天梅毒相似。
梅毒的免疫问题比较复杂,人类可对梅毒螺旋体产生细胞免疫与体液免疫。细胞免疫在梅毒的免疫中的作用还不清楚。在体液免疫方面,螺旋体进人人体后可产生很多抗体,碳水化合物及某些蛋白组分可引起种特异抗体,后者可与很多非致病性螺旋体发生交叉反应性。此外,脂质成分也可产生抗体,但也不具特异性,其主要抗体为抗心磷脂抗体和抗螺旋体抗体(IgM.IgG.IgA)。值得注意的问题是梅毒螺旋体抗原不会诱发持久的特异性抗微生物免疫性,在有效治疗后第二次感染仍是常见的事。到底是梅毒螺旋体本身还是它的产物具有免疫抑制作用?还是螺旋体通过形态的改变难于发现,使得没有接受治疗的病人继续恶化?这些问题还有待进一步研究。
据全国梅毒流行病学调查协作组对38个城市调查,梅毒总发病率1994年为1.72/10万,1995年为3.91/10万,1996年增加至7.14/10万,1997年-1998年我国东南沿海的省市梅毒发病率更有较大幅度的上升。这说明梅毒再一次在我国流行,并逐年增长。
梅毒的传播途径有:①性接触,这是主要的传染途径;②胎传,患梅毒的妇女可以通过胎盘使胎儿受染;③其他少数可以通过性接触以外的途径受染,如接吻、哺乳、接触被传染性病人污染的日常用品。此外,输血也可致感染。
梅毒的诊断必须依靠病史、症状及实验检查进行综合分析。而梅毒的实验室检查结果对诊断往往具有决定性意义。
梅毒的实验室诊断方法主要有病原体检查和抗体检测。
一、病原体检查
梅毒螺旋体检查是对早期现症梅毒检测的最好方法。诊断一期梅毒、二期梅毒,可取患者损害的渗出物或淋巴结穿刺术得到的组织液,在暗视野显微镜下观察螺旋体的特征性形态和运动方式。通过羊膜穿刺术获得孕妇的羊水作暗视野显微镜观察,对先天性梅毒具有诊断价值。病原学检查的主要方法有暗视野显微镜检查、镀银染色和浓盐酸蒸汽显示法。
(一)暗视野显微镜检查法
原理:梅毒螺旋体侵入人体后,在皮肤粘膜下增殖,并很快沿着淋巴管到达近卫淋巴结,经过2周-4周的潜伏期,在侵入部位发生炎症反应称为硬下疳。数天到1周后,淋巴结肿大。二期梅毒是梅毒螺旋体由局部经淋巴结进入血液,在人体内大量播散后而出现的全身表现,一般发生在感染后的7周-10周或硬下疳出现后6周-24周,主要为皮肤粘膜损害,有扁平湿疣、粘膜斑和玫瑰斑疹等。患梅毒的孕妇可以通过胎盘使胎儿受染。研究证明在好娠7周时,梅毒螺旋体即可通过胎盘。孕妇可用羊膜穿刺获得羊水。上述损害均可检查梅毒螺旋体。
暗视野显微镜检查法:暗视野映光检查采用一个特殊的聚光器,其中央为黑漆所遮蔽,光线不能直接通向镜筒,仅可从其四周边缘斜射到载玻片上。倘若该斜射光线遇到载玻片上的物体如细菌、螺旋体等,由于菌体和周围液体折光率不同,引起散射的光线可通过镜筒达到观察者之目的。因此,物体在暗视野内发光显现,犹如黝暗的黑夜闪烁着点点的星光,也像我们在暗室内看见缝隙透入的阳光中有千万颗尘土微粒跳跃飞舞一样。
材料:暗视野显微镜、钝刀、载玻片、盖玻片、注射器、注射针头、灭菌等渗盐水。
取材:
1.皮肤粘膜损害取材:首先在载玻片(厚度为1.0mm~1.2mm)上放入一二滴盐水备用。 用棉拭子蘸取无菌等渗盐水轻轻擦尽皮损上的污物。如皮损上有痂皮,可用钝刀轻轻除去。嘱患者用手挤压皮损周围,使组织浆液渗出,用钝刀轻轻地刮数次(避免出血),取渗液混入载玻片盐水中,加盖玻片后置暗视野显微镜下检查。
2.淋巴结取材:消毒淋巴结表面的皮肤,用1mL无菌注射器配12号针头,吸取无菌等渗盐水0.25mL~0.50mL,以无菌操作穿刺淋巴结并注入盐水,再吸入注射器内。如此反复二三次后,取少量的淋巴液直接注于载玻片上,加上盖玻片后,置暗视野显微镜检查。
3.羊膜穿刺术:梅毒孕妇的羊膜穿刺术应由专业人员操作,获得羊水直接滴于载玻片上,置暗视野显微镜检查。
方法:
1.显微镜聚光器换上暗视野聚光器,或将奥林巴斯暗视野简易光栏,置于奥林巴斯CE[2]系列显微镜明视野聚光器的滤色片上方。
2.全开光圈并在聚光器上加一滴蒸馏水;
3.按常规方法取可疑分泌物制成的生理盐水涂片,加盖玻片后,置载物台上;
4.上升聚光器使蒸馏水接触载玻片底面,先用10倍物镜,再用40倍物镜观察。注意调整聚光器的高度要适中,使物像清晰为度。寻找有特征性形态和运动方式的梅毒螺旋体。
附:初学者可如上法挑取牙垢标本制成生理盐水涂片,加盖玻片后,置暗视野镜下练习,可清晰见到各种细菌或偶见口腔螺旋体呈活泼运动或分子振动,闪闪发亮。
结果: 暗视野显微镜下,如发现有典型的梅毒螺旋体的特征和运动方式为阳性结果。
(二) 镀银染色法
材料:
1.罗吉氏固定液:冰醋酸1.0mL、甲醛溶液2.0mL、蒸馏水100.0mL。
2.鞣酸媒染剂:鞣酸5.0g、石炭酸1.0g、蒸馏水100.0mL。
3.Fontana氏银溶液:硝酸银5.Og、蒸馏水100.0mL。
临用前,取硝酸银溶液20.0mL,逐渐滴入10%氨液使之形成棕色沉淀经摇匀后恰能重新完全溶解为止。此时,溶液清亮,再加入硝酸银溶液数滴,至溶液摇匀后仍显轻度混浊为止。此液应在临用前配制,不可预制。
方法:
1.将标本于洁净载玻片上作一薄片,于空气中自然干燥(不可用火固定)。
2.用固定液将涂片固定2分钟~3分钟。
3.以无水酒精洗涤。
4.加媒染剂于涂片上,并略加热使产生蒸气,染30秒钟。
5.水洗,加经氨液处理过的银溶液于涂片上,并加热产生蒸气,染30秒钟。
6.水洗,待干,加盖玻片以加拿大胶封闭固定(如直接加镜油易使标本脱色),再用油镜检查。螺旋体显棕黑色,而背景则为淡棕色。
(三)浓盐酸蒸汽显示法
材料
1.1%刚果红溶液。
2.37%浓盐酸。
方法
1.标本的制备同暗视野检查法,待自然干燥。
2.加1%刚果红染液覆盖后,待自然干燥。
3.置标本于浓盐酸蒸汽中(可将玻片标本对准浓盐酸瓶口薰蒸)显色(由红色变为蓝色即可)。
4.显微镜下观察,螺旋体被染成蓝色。
(四)直接检查梅毒螺旋体还可用单克隆免疫荧光法(DFI)、聚合酶链检 测法(PCR)从略。
临床意义
1.暗视野显微镜检查法、镀银染色法和浓盐酸蒸汽显示法,直接镜检到梅毒螺旋体,在临床上可确诊梅毒,且具有快速、方便、易操作等特点。暗视野显微镜检查法己被世界卫生组织指定为性病实验室必备项目之一。由于镀银染色法配制较难,故敏感性较差,而浓盐酸蒸汽显示法易造成皮肤烧伤,操作时应特别细心。
2.螺旋体检查是检测最早期现症梅毒的最好方法,对患者早期诊断、及时治疗、预后和尽早切断传染源有十分重要的意义。对梅毒感染者,能在血清抗体出现前进行抗梅毒治疗,是最好的治疗时机。
注意事项
1.取材前,应用无菌等渗盐水清洁皮损表面。
2.钝刀要消毒,取材时应取到组织渗出液,以提高阳性率,并尽量避免出血。
3.取材后应立即置暗视野镜下观察。
4.暗视野检查要观察到梅毒螺旋体的特征性形态和运动方式,对口腔溃疡标本,应与其他螺旋体相区别。镀银染色法和浓盐酸蒸汽显示法要观察到梅毒螺旋体的典型形态。
5.如未观察到梅毒螺旋体,并不能排除梅毒的可能性,这可能是由于取材不当或皮损处螺旋体数量不足,患者近期用过抗菌素,损害已接近自然消退等原因引起。可让病人复查及进行血清学追踪观察。
二、梅毒血清学检查
当人体感染梅毒螺旋体后4周~10周左右,血清中可产生一定数量的抗类脂质抗 原的非特异性反应素抗体(主要是IgM和IfG)和抗梅毒螺旋体抗原的特异性抗体(主要是IgG、IgM)。可用各种免疫学方法来检测此两种抗体作为协助诊断梅毒的重要手段和不可缺少的步骤。
由于梅毒病期的复杂性,病期长和时隐时现的特点,以及临床上生理性和生物学假阳性的存在,故将临床血清试验分为两大类:一类为非梅毒螺旋体抗原血清试验,常用性病研究实验室试验(VDRL)、不加热血清反应素试验(USR)、血浆反应素环状卡片试验(RPR、TRUST),主要应用于初筛试验和疗效观察;另一类为梅毒螺旋体抗原血清试验,常用有梅毒螺旋体血球凝集试验(TPHA)、梅毒螺旋体明胶颗粒凝集试验(TPPA)、荧光梅毒螺旋体抗体吸收试验(FTA-ABS)、19sIgM梅毒螺旋体血球凝集试验(19sIgM.TPHA)试验,主要应用于确证试验,对疗效观察意义不大。
(一)非梅毒螺旋体抗原血清试验
梅毒螺旋体一旦感染人体,宿主迅速对螺旋体表面的脂质作出免疫应答,在3周-4周产生抗类脂抗原的抗体(反应素)。这些抗体主要是IgG和IgM型混合抗体。反应素对机体无保护作用。未经治疗的病人,其血清内的反应素可长期存在。经适当治疗后,抗体可以逐渐减少至转为阴性,因此可用于疗效观察及判愈。目前对反应素的本质尚有争议:有人认为它是宿主感染梅毒螺旋体后,组织受到破坏而裂解出来的一种类脂成分,这种成分作为半抗原与梅毒螺旋体的蛋白质结合成完全抗原,刺激机体所产生抗类脂质抗体;也有人认为它是能与组织类脂起反应的抗梅毒螺旋体的抗体。当血清中含有抗类脂质抗体时,体外试验可与0.03%心磷脂、0.21%卵磷脂和0.9%固醇组成的VDRL抗原发生反应。这种抗体与从牛心提取的心磷脂,在体外有抗原一抗体反应。试验所用的卵磷脂,是从动物或植物中提取的,作用是加强心磷脂的抗原性。胆固醇可增强抗原的敏感性。心磷脂、卵磷脂、胆固醇都是醇溶性脂类,遇水形成胶体溶液,胆固醇遇水析出结晶。当抗原与梅毒血清抗体(免疫球蛋白IgG、IgM)混合时,后者即粘附在胶体微粒的周围,形成疏水性薄膜。由于摇动、碰撞,形成抗原抗体复合物,就像编织的一个大网使颗粒被网住而形成肉眼可见的凝集颗粒,即为阳性反应。如果遇到非梅毒血清,因体液中的白蛋白多于球蛋白,白蛋白对胶体颗粒有保护作用,形成亲水性薄膜,即使同样摇动碰撞,也由于抗原颗粒周围没有粘附免疫球蛋白的作用,不能形成较大颗粒,没有肉眼可见的凝集和沉淀,因此为阴性反应。常用的VDBL、USR、RPB、TRUST等试验均为此类试验,它们具有相同的抗原成分,所以敏感性相似,其特异性受生物学假阳性反应和某些生理性反应的影响,假阴性反应主要是前带现象。
上述初筛试验结果均可用肉眼观察,VDRL、USR可用显微镜核查以助结果的判定。
性病研究实验室试验(venersal disease research laboratory test,VDRL)
材料
VDRL试剂盒: (1)VDRL抗原; (2)VDRL缓冲液:PH6.0±0.1; (3)0.85%NaCl溶液; (4)每毫升60滴±1滴的标准针头和直径14mm漆圈反应板; (5)30mL平底小瓶。
方法]:
1.VDRL抗原配制方法
(1)吸取0.3mLVDRL缓冲液置30mL小瓶;
(2)吸取0.3mLVDRL抗原逐滴迅速地加入小瓶内的VDRL缓冲液内(约4秒钟),随后摇动10秒钟,使之混匀;
(3)立即加2.4mLVDRL缓冲液,盖上瓶盖,来回颠倒摇动小瓶10秒钟30次,即为VDRL抗原。此抗原仅可用1天。
2.VDRL玻片定性和定量试验 方法与USR试验完全相同,由于VDRL抗原配制时混悬的技术较高,而配制成的VDRL抗原仅可使用1天,往往会造成抗原的浪费(每次最少量需配制约200人份量),而且待测血清需在试验前灭活,故给实验室带来许多不便,临床上除用于脑脊液检查外已甚少采用此法。
不加热血清反应素试验(unheated serum reagin test,USR)
原理
USR试验是一种改良的VDRL试验方法。将配制的VDBL抗原经离心后将沉淀物重.悬于含有乙二胺四醋酸(EDTA)、氯化胆碱和磷酸盐缓冲液中。由于EDTA可使抗原在12个月内不变性,氯化胆碱可起“化学灭活”的作用,因此,血清标本不需要加热灭活,抗原不必每天配制,在4℃~8℃冰箱可保存12个月,较为简便。
材料
1.USR试剂盒 (1)USR抗原; (2)直径14mm圆圈的一次性塑料(玻璃)反应板; (3)45滴±1滴/mL的标准针头; (4)USR反应结果标准照片。
2.可调血凝震荡器
方法
1.USB定性试验 (1)吸取0.05mL血清放入反应板圆圈内,将血清扩散到整个内圈; (2)用标准针头每个标本加入1滴抗原; (3)用手或置震荡器上摇动4分钟,180次±5次/分钟,立即肉眼观察或置100倍显微镜下观察。
结果:(参照反应结果标准照片) (1)有大的或中等大小的絮状物,溶液清亮……3+~4+强阳性反应 (2)絮状物比较小,悬液较清亮 ……2+阳性反应 (3)絮状物较小,均匀分布,液体混浊 ……1+ 弱阳性反应 (4)抗原颗粒稍粗 ……± 可疑,一般属 (5)抗原颗粒均匀,针状细小 ……- 阴性反应
2.USR定量试验
经定性试验为阳性、弱阳性或可疑反应的标本需做定量试验,前者为明确抗体滴度,后者为排除“前带现象”。
(1)在反应板2孔~6孔各加等渗盐水50μL;
(2)吸50μL血清标本加入第1孔为原倍血清,再吸50μL血清至第2孔混匀,吸50μL至第3孔,如此倍比稀释至第6孔,吸50μL弃去,如此6孔稀释度为:原倍、1:2、1:4、1:8、1:16、1:32,必要时可继续稀释至1:64、1:128或更高;
(3)每个稀释度加入抗原1滴;
(4)振荡速度、时间和结果观察同定性试验。 快速血浆反应素环状卡片试验(rapid plasma reagin circle card test ,RPR)
原理: RPR试验是VDRL试验的一种改良方法。该试验是在USR抗原中加入碳颗粒作为指示物,特制的白色纸卡替代了玻璃反应板。血清不需灭活,肉眼可观察结果,试验结果可保存。抗原放4℃冰箱可保存1年。
材料:
1.BPR试剂盒 (1)BPR抗原; (2)直径为18mm圆圈的特制白色反应卡片; (3)60±1滴/mL滴标准针头。
2.可调旋转器。
方法:
1.定性试验 (1)吸取0.05mL血清或血浆放在卡片圈内,并均匀地涂布整个圈内(每张纸卡有10个或12个反应圈); (2)将BPR抗原轻轻摇匀,用标准针头吸取抗原,每个标本中加1滴抗原; (3)将卡片置旋转器旋转8分钟,(100±5转)/分钟; (4)立即在强光下观察结果。
结果: (1)圆圈内出现小至大的黑色絮状物为阳性,不分其阳性的程度。必要时可依絮状物的大小和多少,用“+”号表示。 (2)圆圈内仅见碳颗粒集于中央一点或均匀分散为阴性。
2.定量试验(在纸卡上进行): (1)在纸卡圆圈内加入0.05mL等渗盐水(一般作6个圆圈),勿将盐水涂开; (2)吸取0.05mL血清或血浆作系列稀释(1:2~1:64),最后所稀释的圆圈内应弃去0.05mL; (3)滴加抗原、旋转时间和速度、观察结果同定性试验。
甲苯胺红试验(tolulized red unheated serum test,TRUST)
原理
TRUST试验原理与RPR试验原理相同。唯TRUST抗原中加入甲苯胺红染料颗粒代替碳颗粒作为指示物,使阳性结果出现红色絮状凝集现象,阴性结果见甲苯胺红颗粒集于中央一点或均匀分散。
方法
TRUST试验方法及结果均同EPR试验。
注意事项
1.实验环境温度应为23℃~29℃;抗原应保存于4℃冰箱,试验前应恢复到室温。抗原应防止冻结,以免破坏。
2.校准针头,VDBL、RPB、TRUST等抗原(用9号针头)为60±1滴/mL,USR抗原(用12导针头)为45滴±滴/mL。一般试剂盒内已有配套专用针头。
3.试验标本应防止污染,放置室温应在24小时内完成。如血清56℃灭活或放4℃保存,在试验前应恢复试验温度后再开始试验。
4.试验完毕,应立即(三分钟内)观察结果。
临床意义
1.非梅毒螺旋体抗原血清试验具有较高的敏感性和特异性,对未经治疗的一期、二期、潜伏、晚期梅毒,VDRL、USR、BPR、TRUST试验的敏感性分别为78%(74%~87%)、80%(77%~88%)、86%(77%~99%)、86%(77%~86%)。对上述试验,二期梅毒都为lOO%;潜伏梅毒为%%(88%~100%)、95%(88%~lOO%)、98%(95%~100%)、98%(95%~100%);晚期梅毒为98%(96%~99%)、99%、98%(93%~99%)、99%(98%~99%)。这些试验都可用于梅毒的筛查和治疗效果的检测。
2.此类试验的优点: 方法简易、快速、敏感性和特异性好。适用于大量人群的血清筛查。早期梅毒硬下疳出现一二周后可呈阳性,经治疗后血清滴度可下降并转阴性,故可作为疗效观察、判愈、复发或再感染的指征。
3.临床应用的注意点:
(1)凡定性试验阳性(+以上)者,确诊或治疗前均应做定量试验,以明确患者抗体滴度,除外“前带现象”(这是由于抗原抗体量比例不适,抑制阳性反应的结果)。活动性梅毒滴度可在1:8~1;64,有的可达1:256,甚至1:1280。血清定量试验的作用可作疗效和预后观察。早期梅毒足量正规治疗后,可于6个月~24个月左右转阴(据统计:6个月有24%阴转,一年有73.8%阴转,二年内有96.9%阴转)。一般使血清阴转所需的时间和病程成正比。复发或再感染时可阳转或滴度上升。定量试验2次结果,滴度上升2个稀释度以上(如1:2上升到1:8以上)才可判为上升(应注意排除技术性因素)。不同试验方法(如USR与RPR),滴度不宜进行比较。
(2)因此类试验是非特异性抗原试验,故试验阳性时,应注意排除技术性(试剂或操作)、生理性(孕妇可有0.4%假阳性)和急、慢性生物学性假阳性的可能,特别是胶原性疾病和自身免疫病,如麻风、红斑狼疮、类风湿、慢性风湿性心脏病、海洛因成瘾等。某些急性发热病后(如风疹、疟疾、水痘、肺炎、传染性单核细胞增多症)和免疫接种等,可出现暂时性假阳性,多可在疾病消退后数周至6个月内转阴。一般来说患者血清滴度在1:8以上是梅毒的可能性大,低于1:8时,应考虑到上述疾病的可能,并应用特异性试验来证实。
(3)血清固定:由于梅毒病程和治疗时机以及治疗方法等原因,有些患者出现的血清抗体在若干年内仍保持低滴度阳性(1:4以内)或弱阳性(+)反应,这称为血清固定。在注意排除神经梅毒后,有否重新治疗的必要,要视临床情况来决定。
(4)此类试验可鉴别早期、晚期潜伏梅毒。前者治疗后滴度下降快,后者滴度下降慢或不变。
(5)有助于鉴别先天梅毒被动抗体反应素血症。因生母的反应素可通过胎盘到胎儿血中,如胎儿未染,出生三四月后可自动阴转,如果滴度不减或反而上升,即可诊断为先天梅毒。
(6)治疗后随访二三年,第1年每3个月复查一次,以后每半年复查一次。复查时主要做USR或RPR定量试验,观察抗体。
(7)若病人为HIV感染者,其梅毒血清反应有时会出现难于解释的现象;艾滋病人合并感染梅毒者,其梅毒血清试验均呈阴性。因此对于怀疑梅毒者,建议同时进行HIV抗体检查。
二)梅毒螺旋体抗原血清试验 采用梅毒螺旋体作抗原,是特异性的抗原抗体反应,用以检测梅毒IgG、IgM抗体,常用的有TPHA认(血凝法)和FPA-ABS(荧光法),近年日本研制出TPPA法。 梅毒螺旋体血球凝集试验(trepomema palidum hmagglutination assay,TPHA)
原理
TPHA试验是用超声裂解的梅毒螺旋体为抗原,致敏经醛化、鞣化的羊或禽类红细胞,这种致敏的红细胞一旦与抗梅毒抗体或免疫血清相遇时,在适宜的条件下,产生肉眼可见的凝集。这一反应的特征是用间接血凝法测定人血清或血浆中的梅毒螺旋体的特异性抗体,只要有微量的抗体(血清通常用作1:80以上稀释)就可使致敬的红细胞发生凝集作用。试剂盒内的血清吸收剂可消除试验中的生物学假阳性反应,提高试验的特异性。TPHA试验用于确诊梅毒,具有快速、简便、敏感和特异等特点。 1987年进入我国市场的日本产的TPHA试剂盒由羊红细胞配成,致敏细胞和非致敏细胞为冻干品,应用前需经繁琐的稀释,配成细胞应用液,有效期短,反应时间长,需4小时才能观察结果,故已被该公司的新产品TPPA及其他国家改良的TPHA所替代。 近几年来,国外(西班牙、荷兰、英国)已有改用禽类红细胞做成的致敏和非致敏 细胞混悬液,内中已含有非特异性吸附剂,试验时可直接使用,方法简便,一小时可读 取结果。
材料
试剂盒(介绍西班牙Biosystems 公司SYPHILIS TPHA ,每盒200人份) (1)36105试验细胞(Test Cells):致敏细胞7.5mL*2瓶; (2)36203质控细胞(Control Cells):非致敏细胞7.5mL*2瓶; (3)36302稀释缓冲液(Diluent Buffer):40mL*1瓶; (4)36204阳性质控液(Positive Control):1:20稀释,±1个倍比稀释度; (5)36205阴性质控液(Negative Control ):1:20稀释。
方法
1.标本采集 血清:凝固血液经离心分离新鲜血清,或保存于2℃~8℃或~20℃的血清。溶血、 脂血或污染的标本可能影响试验结果。 血浆:血库血,EDTA抗凝血浆同样可用于梅毒试验,但有假阳性反应(需用血清 复试),如用其他抗凝剂应评价后使用。
2.定性试验 试验前所有试剂应恢复到室温(15℃~25℃),并充分混匀。用U型反应板,每个 试验4孔,第1、第2孔用于标本的稀释: (1)加稀释液至反应板,第1孔25μL,第2孔100μL,第3、4孔各25μL; (2)取血清25PμL加至第1孔,混匀后取25μL至第2孔,混匀后取25μL至第3孔, 取25μL弃去,再从第2孔取25μL至第4孔,混匀弃去25μL; (3)第3孔加质控细胞75μL,第4孔加试验细胞75μL; (4)将反应板置震荡器震荡30秒,或用手轻轻拍打混匀; (5)置有益湿盒内,于室温(或空调室内)15℃~25℃避光避震孵育1小时,观察 结果。 (6)质控:必要时做阴性和阳性对照。阴、阳性质控液已稀释为1:20,试验时可直接各加25μL于第三四孔,无需再稀释,再按上述(3)~(5)进行。
3.定量试验 每个试验8孔~10孔,其中1孔~4孔稀释与定性试验同。 (1)加稀释液至U型反应板,第1孔25μL,第2孔100μL,第3孔~8孔或第10孔 各加25μL。 (2)取血清25μL加至第1孔,如定性试验法稀释血清,至第4孔,混匀后取25μL至第5孔,如此倍比稀释至8孔或10孔,取25μL弃去; (3)第3孔加质控细胞75μL,第4孔~8孔或10孔各加试验细胞75μL; (4)~(5)同定性试验法。结果以最高稀释度血清能产生+凝集的稀释度为抗体滴度。
结果
细胞光滑覆盖整个孔底,有时边缘有折叠。
阳性4+: 细胞光滑覆盖大部分孔底
阳性3+: 细胞光滑聚集覆盖孔底,周围有一细胞环
阳性2+ :细胞光滑聚集覆盖孔底,周围有一明显细胞环
阳性1+: 细胞沉集孔底,中央形成一小环
: 可疑+ - 细胞紧密沉集孔底中央
阴性-
报告方法: 血清1:80以上与致敏细胞产生+以上凝集,未致敏细胞不出现凝集者,可作出阳性报告。如做定量试验则应报告血清最高稀释度仍产生凝集的滴度。 例如TPHA试验结果:阳性(1:640)。 血清试验结果,致敏和非致敏细胞均不产生凝集时,报告试验结果:阴性。
注意事项
1.TPHA反应板要清洁干净,孔内无异物;
2.试剂盒不可置0℃以下,防止冻结,不同批号试剂间不可混合使用;
3.试验室温15℃~25℃,天热时应将湿盒置空调室或盒内放一些冰块。 4.如未致敏细胞出现凝集反应,应改用其他试验方法。
临床意义
1.TPHA试验具有敏感性高、特异性强、操作简便、无需特殊设备等特点,是梅毒较好的确证试验。对治疗前梅毒的敏感性:一期梅毒为76%(69%~90%)、二期梅毒为100%、潜伏梅毒为97%(97%~100%)、晚期梅毒为94%,特异性为99%(98%~99%)。
2.一般认为,TPHA试验阳性患者,由于记忆细胞抗体复制能力强,特异性试验敏感性高,即使经过抗梅治疗也终生阳性,因此不能作为治疗效果观察的指标。但根据临床观察,早期梅毒患者血清如TPHA试验为弱阳性反应,有可能阴转。
3.特异性试验对一期梅毒可比非特异性试验早一周出现。梅毒过程中最初出现的是IgM抗体,梅毒感染后第二周即可从血清测出,而IgG抗体则需在感染后第四周方可测出。因此检测19sIgM抗体可作为梅毒早期诊断或胎传梅毒的确诊。19sIgM治疗后阴转较快,在梅毒螺旋体抗原消失后不久,此抗体也随之消失。据文献报道经有效治疗后,一期梅毒3个月,二期梅毒9个月IgM抗体达到100%阴转。
4.梅毒确证试验,一般定性试验阳性,则可作梅毒诊断依据,必要时做定量试验。经有效治疗后特异性抗体滴度也可不同程度下降,可降至1:160或1:80。
5.此类试验特异性强,很少出现假阳性。但据统计,也可有1%生物学假阳性存 在,如红斑狼疮(SLE)可使FTA-ABS呈假阳性,而传染性单核细胞增多症,可能由 于嗜异性抗体所致,可使TPHA呈假阳性;麻风病人的非特异性试验假阳性可高达 40%,特异性试验有的也可呈阳性。 梅毒螺旋体明肢凝集试验(treponema pallidum particle assay,TPPA)
原理
] TPPA试验原理与TPHA基本相同。TPPA试验用梅毒螺旋体致敏明胶颗粒替代 TPHA试验中致敏的红细胞,此致敏颗粒与人血清或血浆中的梅毒螺旋体抗体结合,产 生可见的凝集反应,具有较高的敏感性。明胶粒子为洋红色,在操作步骤上也较为方 便,出结果较快。
材料
试剂盒(有100、220、550Test /盒三种包装)
(1)“A”溶解用液:用于溶解致敏颗粒“C”和非致敏颗粒“D”;
(2)“B”,血清稀释液:用于血清标本的稀释;
(3)“C”致敏颗粒(冻干):明胶颗粒结合纯化的梅毒螺旋体抗原,用前30分钟按 规定量加“A”液溶解混匀;
(4)“D”非致敏颗粒(冻干):用前30分钟按规定量加“A”液溶解混匀;
(5)“E”阳性质控血清(液体):为含梅毒抗体的兔血清制成,最终滴度1:320, 其试验方法与定量试验同,可稀释至第7孔或第8孔。
方法
1.定性试验(用U形反应板) 孔 号 1 2 3 4 血清稀释液“B”,(μL) 100 25 25 25 血清标本 (μL) 25 25 25 25 弃去μL 标本稀释度 1:5 1:10 1:20 1:40 加非致敏颗粒“D”(μL) - - 25 - - - - - 加致敏颗粒“C”(μL) - - - 25 25 25 25 25 25 25 血清最终滴度 1:40 1:80 置微型振荡器振荡30秒,或用手轻轻拍打混匀,置有盖湿盒内,室温(15℃~ 30℃)2小时后观察结果。
2.定量试验 孔 号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 加“B”液(μ) 100 25 25 25 25 25 25 25 25 25 血清标本(μL) 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25弃去 血清稀释度 1:5 1:10 1:20 1:40 1:80 1:160 1:320 1:640 1:1280 1:250 加“0”液(μL) - - 25 - - - - 加“C”液(μL) - - - 25 25 25 25 25 25 25 血清最终稀释度 1:40 1:80 1:160 1:320 1:640 1:1280 1:2560 1:5120 用血凝振荡器振摇30秒,置有盖湿盒内,室温2小时后,观察结果。
结果
颗粒凝集覆盖于整个子L底,可呈多边形膜状,边缘粗糙……阳性2+~4+ 颗粒凝集呈多形性粗糙大环状 ……阳性1+ 颗粒浓集呈边缘光滑的小环状 ……可疑± 颗粒聚集在于孔中央、光亮、边缘光滑 ……阴性-
3.重吸收试验 孔内标本与非致敏和致敏颗粒均产生凝集者,标本需作下列重吸收试验:
(1)加0.95mL非致敏颗粒溶液于小试管内。
(2)加入50μL血清,充分混匀,置室温吸收30分钟以上。
(3)离心2000rpm 5分钟,吸取上清液50μL加入孔3。
(4)自孔4~孔10各加血清稀释液“B”25μL。
5)自孔3吸25μ至于孔4,混匀后吸25μL至孔5……如此稀释至孔10,弃去25μL。
(6)按定量试验法加入“D”和“C”,振摇30秒,置有盖湿盒室温2小时,观察结果。
注意事项
1.用“A”,液溶解“C”和“D”明胶颗粒后,应置室温30分钟以上才能使用。每次用前应将“C”和“D,,恢复室温并充分摇匀。试剂盒内配有专用滴管,应严格标明“C”和“D”,不能混用。此滴管每滴为25μL,用于加“C”和“D”液,不能用来稀释血清。
2.试验加入“C”和“D,'颗粒后,应用微型血凝振荡器混匀,不能用旋转式振荡器振摇。
3.红细胞及其它血液的有形成分会影响结果,所以血液标本应离心分离血清,血清标本无需灭活,灭活的血清不影响结果,但血浆标本不能灭活。
4.保存:试剂应保存于2℃~10℃。
5.其他注意事项同TPHA。
临床意义
TPPA试验在我国用于临床检测梅毒刚开始不久,已有文献报道TPPA试验对一期梅毒的敏感性高于TPHA试验。临床使用效果还有待今后评价.
 
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